viernes, 11 de septiembre de 2015

Las primeras etapas de vida de los calamares oceánicos y su estudio a través de fecundación in vitro


 Por Fernando Ángel Fernández-Álvarez (1), Elisabeth Cuesta-Torralvo (1), Laura Roig (1), Georgina Valls (1), Catarina P.P. Martins (1), Jose V. Mirabel  (1), Daniel Quintana (2), Pilar Sánchez (1), Erica A.G. Vidal (1, 3) y Roger Villanueva (1)

"Los cefalópodos (nautilos, calamares, sepias y pulpos) es un grupo de animales con una biología reproductiva dispar: desde animales longevos que realizan varias puestas hasta otros que se reproducen unas pocas veces al final de su fugaz vida. La mayoría de los cefalópodos actuales son representantes de este segundo grupo. Algunos cefalópodos colocan sus huevos en lugares relativamente accesibles para los investigadores, sin embargo, los calamares oceánicos realizan puestas en mar abierto, por lo que estudiar su desarrollo es realmente difícil. Una alternativa al estudio de puestas salvajes es realizar fertilizaciones in vitro y estudiar su descendencia en condiciones controladas de laboratorio."
(1) Institut de Ciències del Mar (CSIC), Passeig Marítim 37-49, 08003 Barcelona, España.
(2) Centro de Prospectiva Estratégica, Instituto de Altos Estudios Nacionales (IAEN), Av. Amazonas N37-217 y Villalengua, Quito, Ecuador.
(3) Centro de Estudos do Mar, Universidade Federal do Paraná (UFPR), Cx. Postal 61, Pontal do Paraná, PR. 83.255-697, Brasil.
“Los investigadores que firman este artículo pertenecen o han pertenecido en el pasado cercano al grupo de investigación CALOCEAN, en el Institut de Ciències del Mar de Barcelona. Les une su pasión por desentrañar los secretos que esconden las primeras fases del desarrollo de los cefalópodos, en especial de la familia de los ommastréfidos.”

  Los cefalópodos son el grupo de invertebrados marinos que comprende los pulpos, calamares, sepias y nautiloideos. Las formas vivientes actuales son el legado de la enorme biodiversidad de cefalópodos que dominaron los mares del mundo en épocas pasadas, como los ammonoideos y los belemnoideos. Este grupo de animales se ubica en el Filum de los moluscos, un diverso grupo de organismos que comprende desde las almejas y ostras hasta algunas especies que han colonizado tierra firme, como el caso de los caracoles terrestres. Los cefalópodos  presentan una gran diversidad de morfologías y cabe destacar que son los invertebrados que mayor talla pueden llegar a alcanzar, hasta los más de 15 metros de longitud total (incluyendo los tentáculos) del calamar gigante (Architeuthis dux, Figura 1). Con algunas excepciones, como el calamar vampiro (Vampyroteuthis infernalis), los cefalópodos son activos  depredadores, lo cual implica que comprender su biología y cómo interaccionan con otros seres es de vital importancia para el correcto conocimiento del medio marino.

Calamar gigante © Fernando Ángel Fernández-Álvarez

Figura 1. Investigadores practican una disección pública de un ejemplar de calamar gigante (Architeuthis dux) durante las II Jornadas Científico-Gastronómicas de Cefalópodos de Luarca, en septiembre de 2013. Esta especie de calamar oceánico es la especie de invertebrado más grande conocida, pudiendo alcanzar más de 15 metros de longitud total y unos 150 kilos de peso. Al igual que en el resto de los calamares oceánicos, se sabe muy poco sobre las primeras fases de su desarrollo. © Fernando Ángel Fernández-Álvarez.


Además de su importancia ecológica, este grupo de organismos ha suscitado desde la antigüedad todo tipo de intereses. Referencias a grandes cefalópodos forman parte del folclore de numerosos pueblos, como las vívidas descripciones del comportamiento de un pulpo desalojado de su guarida en la Ilíada o las leyendas del monstruoso Kraken de la mitología escandinava. Este interés no se debe sólo a su singular morfología, sino que muchas especies presentan un elevado interés comercial que genera una intensa actividad investigadora en torno a su explotación pesquera (FAO, 2014) y, en el caso de algunas especies, por sus posibilidades en acuicultura (Iglesias et al., 2014; Vidal et al., 2014). La reducción de las capturas pesqueras experimentada en muchas especies marinas (principalmente peces) ha conducido a incrementar el esfuerzo sobre otros recursos pesqueros, especialmente invertebrados. El interés por los cefalópodos no sólo deriva de sus propiedades gastronómicas y su elevado valor comercial. Ciertas características fisiológicas y anatómicas, como las neuronas con axones gigantes de los calamares, su sistema nervioso centralizado y sus capacidades de aprendizaje, han proporcionado a estos organismos interés en el terreno de la biomedicina, razón por la cual llevan investigándose en esta disciplina desde hace más de 100 años (Fiorito et al., 2014).

Todos los cefalópodos actuales pertenecen al mismo grupo (los Coleoideos), a excepción de Nautilus (Figura 2), cuyo origen se remonta a épocas pretéritas y constituye una reliquia viviente de un grupo mucho más diverso en el pasado. En la tabla 1 se detalla la clasificación actual de este grupo de organismos.

 
Nautilo © Fernando Ángel Fernández-Álvarez

Figura 2. El nautilo es el representante más primitivo de los cefalópodos existentes. Presenta una concha externa con cámaras que le ayudan a regular su posición en la columna de agua mediante el llenado y vaciado de éstas con gas. © Fernando Ángel Fernández-Álvarez.

Grupos cefalópdos © Marc Gasser (A) © Elisabeth Cuesta-Torralvo (B-D)

Figura 3. Representantes de los grupos más importantes de cefalópodos: A, el pulpo blanco (Eledone cirrhosa); B, la sepia elegante (Sepia elegans); C, el calamar europeo (Loligo vulgaris) y D, la pota voladora (Illex coindetii). Las barras de escala representan 1 cm. A la izquierda se presenta la superficie dorsal del animal; a la derecha, la ventral. Fotografías E. cirrhosa © Marc Gasser; resto © Elisabeth Cuesta-Torralvo.

Tabla 1. Resumen de los principales grupos de cefalópodos actuales

Cefalópodos
Nautilos
 (Fig. 2)
Son considerados fósiles vivientes. Son los únicos cefalópodos actuales con concha externa. De sus huevos emergen juveniles parecidos a los adultos.



Coleoideos
Decapodiformes  (8 brazos y 2 tentáculos)
Sepias (Fig. 3B)
Presentan una concha calcárea interna bien desarrollada (sepión o jibión) con la que regulan su flotabilidad. Vinculados al fondo de ecosistemas costeros; de sus huevos emergen juveniles parecidos a los adultos.
Calamares
Forma fusiforme y concha interna en forma de pluma

Calamares costeros
(miópsidos) (Fig. 3C)
Asociados a la plataforma costera, presentando  aletas alargadas en sentido longitudinal. De sus huevos emergen paralarvas planctónicas que se alimentan de componentes del plancton.


Calamares oceánicos (oegópsidos)
(Figs. 3D)
Viven en la columna de agua, tienen las aletas cortas en el sentido longitudinal. Presentan una gran diversidad de paralarvas con distintas morfologías y tamaños. Los ommastréfidos (la familia principalmente estudiada por el grupo CALOCEAN) presentan una paralarva especial conocida como paralarva rhynchoteuthion.
Otros grupos menores
Como sepiólidos y espirúlidos, en la mayor parte de los casos sin valor comercial y con escaso conocimiento de su ecología.


Octopodiformes (8 brazos)
Pulpos (Fig. 3A)
Concha interna reducida (en las especies costeras similar a dos palillos translúcidos). Son animales bentónicos en su mayor parte; unas especies tienen paralarvas planctónicas, y otras presentan formas juveniles bentónicas muy parecidas al adulto.


Calamares vampiro
Actualmente incluyen una única especie, habitan aguas profundas y se alimentan de restos de otros organismos.
 

Los cefalópodos actuales presentan dos tipos de estrategias vitales claramente diferenciadas. Por un lado, los nautilos (representados únicamente por dos géneros) son los únicos cefalópodos vivientes que poseen una concha externa, pueden llegar a vivir hasta 20 años, reproduciéndose una vez al año y regenerando sus gónadas hasta el próximo ciclo reproductor (organismos iteróparos). Por otro lado, el resto de los cefalópodos (los coleoideos), tienen un único periodo de madurez sexual (organismos semélparos) que puede ser más o menos extenso y, con la excepción de las especies abisales y de aguas frías, presentan un crecimiento relativamente rápido completando su ciclo vital en menos de 2 años. A pesar del enorme interés evolutivo, biológico y económico de la reproducción de los cefalópodos, el conocimiento actual sobre este tema se basa en gran medida sobre un pequeño número de especies-modelo relativamente bien estudiadas, como la sepia europea (Sepia officinalis), el calamar común europeo (Loligo vulgaris), el calamar de aleta ancha del Indopacífico (Sepioteuthis lessoniana), el calamar gigante del Pacífico (Dosidicus gigas), el pulpo común (Octopus vulgaris) y el pulpo mexicano (Octopus maya).

Brazos macho pota europea © Fernando Ángel Fernández-Álvarez y Catarina P. P. Martins

Figura 4. Vista ventral del par IV de brazos de un macho pota europea (Todarodes sagittatus). Se aprecian las típicas papilas carnosas del hectocotilo que presenta esta especie en su brazo derecho (a la izquierda en la fotografía), utilizado para la transferencia de espermatóforos durante la cópula. La barra de escala equivale a  1 cm. © Fernando Ángel Fernández-Álvarez y Catarina P. P. Martins.
 
Espermatóforos © CALOCEAN

Figura 5. Espermatóforos de pota voladora (Illex coindetii). Esta estructura tiene por función el almacenamiento y eyección de los espermatozoides, presentando una estructura muy compleja que, incluso, representa un carácter taxonómico (que permite diferenciar distintas especies). Los espermatóforos, transferidos por el macho, quedan anclados durante días o semanas en distintas partes del cuerpo de la hembra, dependiendo de  la especie (parte interna del manto, brazos, alrededor de la boca, etc). El proceso por el cual la hembra maneja este esperma y fecunda sus oocitos es escasamente conocido. © CALOCEAN.

 
Aparato reproductor macho y hembra pota voladora y costera © CALOCEAN

Figura 6. Vista ventral del aparato reproductor de un macho de pota voladora (Illex coindetii) y de una hembra de la pota costera (Todaropsis eblanae), especies utilizadas en experimentos de fecundación in vitro de calamares oceánicos. Se presentan en postura anatómica el aparato reproductor de la hembra (izquierda) y el macho (derecha), señalándose los principales órganos descritos en el texto. Las barras de escala representan 1 cm. © CALOCEAN.


 Todos los cefalópodos son dioicos (con sexos separados) y presentan dimorfismo sexual. En muchas especies el macho presenta un (en ocasiones, dos) brazo modificado denominado hectocotilo (Figura 4), que es utilizado para la transferencia de paquetes espermáticos a la hembra (espermatóforos, Figura 5) y/o para la eliminación del esperma que otro macho instaló ya en los tejidos de ésta. Los espermatozoides se generan en el testículo (Figura. 6) y se empaquetan en espermatóforos. Algunas especies, como el calamar gigante, presentan un largo órgano terminal por el que se expulsan los espermatóforos y que cumple la función de pene. Tras la cópula, cuando los espermatóforos están alojados en el cuerpo de la hembra reciben el nombre de espermatangios. Por su parte, las hembras generan los oocitos en el ovario (Figura 6), que posteriormente serán liberados atravesando los oviductos y glándulas oviductales. Estas glándulas segregan moléculas responsables de la expansión del corion, la membrana que envuelve el huevo. Sepias y calamares también poseen glándulas nidamentarias, las responsables de configurar diversas capas como cápsulas y masas mucilaginosas que envolverán y protegerán los huevos tras el desove. Sin embargo, estas glándulas están ausentes en Octópodos (pulpos y afines, Figura 3A), grupo en el que mayoritariamente las hembras incuban los huevos, ventilándolos y protegiéndolos de posibles predadores, por lo que sus huevos carecen de las referidas cápsulas o masas mucilaginosas. Únicamente en algunas especies de pulpos abisales los huevos están recubiertos por una cápsula, no siendo incubados por la hembra.

Los calamares costeros (Loligínidos, Figura 3C) desovan  masas de huevos con forma de racimos digitiformes de 10 a 15 cm de longitud que son depositadas sobre estructuras rígidas del fondo (algas, gorgonias, estructuras de origen humano) y abandonadas a su suerte. En cambio, los calamares oceánicos (Figura 3D) generalmente presentan un tipo de reproducción diferente al de los grupos anteriormente descritos: las hembras generan grandes masas gelatinosas y translúcidas en las que los huevos son envueltos. Dichas masas de huevos pueden tener forma cilíndrica u ovoide de 1 a 2 metros de diámetro. Se cree que las masas de huevos de calamares oceánicos flotan entre  masas de agua con diferentes densidades hasta la eclosión de las paralarvas, que es como se denominan a los calamares recién nacidos. A día de hoy se conocen pocas especies de calamares oceánicos que cuiden de sus masas de huevos (Seibel et al. 2005, Bush et al. 2012). 

De los huevos de cefalópodos emerge un recién nacido con un mayor o menor tamaño y grado de desarrollo, tamaño que determinará su forma de vida en sus primeras etapas. En nautilos, sepias y algunas especies de pulpos, el recién nacido es prácticamente como un adulto en miniatura y vive sobre el fondo (a excepción de Nautilus), pero que debe crecer y madurar sexualmente. En calamares y en aproximadamente la mitad de las especies de pulpos, los recién nacidos son de muy pequeño tamaño, casi transparentes y viven formando parte del plancton. Debido a que no presentan un gran proceso de reestructuración morfológica, estas fases “larvarias” son denominadas paralarvas. Habitualmente, las paralarvas viven en la columna de agua alimentándose durante un tiempo variable de distintos organismos planctónicos. A excepción de algunos casos muy concretos, como en algunos pulpos (Villanueva y Norman, 2008), todas las paralarvas de cefalópodos presentan el mismo denominador común: un escaso conocimiento sobre la biología, morfología y ecología de las mismas. En el caso de las paralarvas de los calamares oceánicos denominados vulgarmente como “potas” (familia Ommastrephidae), los tentáculos aparecen fusionados al nacer, en un aparato denominado probóscide, de función desconocida, recibiendo por ello estos recién nacidos el nombre de paralarvas rhynchoteuthion (Figura 7).
Paralarva de Ommastrephidae  © CALOCEAN

Figura 7. Las paralarvas de calamares de la familia Ommastrephidae tienen una morfología característica con respecto al resto de los cefalópodos. Nacen con los dos tentáculos fusionados en una probóscide, cuya función durante la alimentación aún es desconocida. © CALOCEAN.

No todas las puestas de cefalópodos son igual de accesibles para los investigadores, dado que muchas especies las realizan a grandes profundidades o en la columna de agua. En el caso de los calamares oceánicos de la familia Ommastrephidae, la detección de puestas en el océano es muy difícil. Las campañas oceanográficas recolectan larvas salvajes, que ofrecen interesante información sobre su distribución, abundancia y morfología, pero el estudio en condiciones controladas de laboratorio  de su biología y comportamiento  requiere la obtención de puestas en cautividad o el uso de técnicas de fecundación in vitro. El primero de los métodos presenta la dificultad de mantener en  condiciones óptimas los ejemplares adultos. Pese a no estar exenta de dificultades técnicas, la fertilización in vitro es la técnica más accesible en la actualidad para avanzar en el conocimiento de los embriones y paralarvas de los calamares oceánicos. Hasta ahora, se han realizado fertilizaciones in vitro de 2 especies de calamares costeros y 12 especies de calamares oceánicos (Villanueva et al., 2012), generando interesante conocimiento sobre las características del periodo embrionario y larvario. 

Fertilización in vitro de pota voladora © CALOCEAN

Figura 8. Resumen del proceso de fertilización in vitro de la pota voladora (Illex coindetii). A) Los ejemplares que se van a fecundar son adquiridos gracias a la colaboración de pescadores profesionales. B) Disección de una hembra de pota voladora de la que se le extraerá el esperma almacenado en los paquetes espermáticos colocados por algún macho y los oocitos de los oviductos. C) Grupo de paquetes espermáticos extraído de la hembra tras la cópula, conocido como espermatangios. D) Disección de un oviducto. E) Fecundación de los oocitos con esperma extraído de los espermatóforos de un macho o de los espermatangios adheridos a la hembra. F) Adición de extracto de glándula oviductal para que la expansión coriónica pueda producirse. G) Tras unos días de incubación, las paralarvas emergen de los huevos y comienzan a desplazarse; a día de hoy no se ha conseguido que permanezcan dentro del huevo hasta estar totalmente desarrolladas, naciendo en un estadio de desarrollo prematuro. © CALOCEAN.

Para llevar a cabo esta técnica se utilizan ejemplares sexualmente maduros recién fallecidos y recolectados a partir de buques de pesca (Figura 8A). La disección de las hembras maduras (Figura 8B) permite recolectar sus oocitos (Figura 8C) y sumergirlos en el interior de una placa Petri con esperma proveniente de machos (Figura 8E). No basta con mezclar los huevos y esperma, sino que es necesario añadir extracto de glándula oviductal (Figura 8F) de hembras maduras para que el huevo se  desarrolle correctamente con la adecuada expansión del corion (la membrana que envuelve el huevo). Los huevos se incuban en agua de mar en rangos de temperaturas similares a las que se encuentran en su medio natural. La duración del desarrollo embrionario es variable y depende fundamentalmente de la temperatura de incubación (Figura 9). En el caso de las potas (calamares ommastréfidos) se diferencian 30 estadios de desarrollo del huevo, emergiendo una diminuta paralarva de 2 mm de longitud total, con los tentáculos fusionados en una probóscide. Durante los primeros días de  vida se nutren de las reservas de vitelo, pero tras agotarlas se alimentarán exclusivamente de sus capturas. A día de hoy, la dieta de las paralarvas recién nacidas de estos calamares sigue siendo un misterio.  


Desarrollo embrionario pota voladora © Laura Roig

Figura 9. Desarrollo embrionario de la pota voladora (Illex coindetii): desde el huevo fecundado hasta el estadio de paralarva recién nacida, completamente desarrollada. Las cifras indican el número de horas trascurridas tras la fertilización in vitro y posterior incubación  a 17º C: a temperaturas inferiores el desarrollo se ralentiza; a temperaturas superiores, se acelera. Las barras de escala representan 1 mm. © Laura Roig.

A pesar del conocimiento existente sobre la ecología de juveniles, subadultos y adultos de calamares oceánicos, lo que se sabe sobre sus huevos y paralarvas es muy limitado, no conociéndose prácticamente nada de la mayoría de las 226 especies descritas hasta la actualidad.  Los calamares ommastréfidos representan el mayor volumen de capturas mundiales de cefalópodos, llegando a representar casi la mitad de la pesquería (FAO, 2014). Sin embargo, aspectos tan básicos para entender su ecología y las interacciones con otros animales como son la distribución batimétrica de las puestas o la primera alimentación de las paralarvas son profundamente desconocidos. Uno de los principales retos a superar es el cultivo de las paralarvas en condiciones experimentales (Figura 9), objetivo no alcanzado todavía por ningún grupo de investigación. Probablemente, el principal escollo a superar es la obtención de una dieta adecuada para su primera alimentación. Una vez este objetivo haya sido alcanzado, se podrían abrir las puertas al cultivo experimental de estos cefalópodos y descubrir aspectos tan fundamentales como de qué se alimentan o cómo evoluciona su comportamiento a lo largo del desarrollo.

La mayoría de las especies de cefalópodos sobre las que se han realizado estudios sobre las primeras fases de su desarrollo tienen valor comercial. La ampliación de este tipo de estudios a otras especies de calamares pelágicos o habitantes de aguas profundas puede ofrecer nuevas perspectivas sobre la dinámica de estos sistemas marinos tan poco conocidos en la actualidad.

Bibliografía

Bush, S. L., Hoving, H. T., Huffard, C. L., Robinson, B. H. y Zeidberg, L. D. (2012). Brooding and sperm storage by the deep-sea squid Bathyteuthis berryi (Cephalopoda: Decapodiformes). Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, 92: 1629-1636.
FAO. (2014). FAO Yearbook 2012. Fishery and aquaculture statistics. FAO, Roma. 105pp.
Fiorito, G.,Affuso, A., Anderson, D. B., Basil, J., Bonnaud, L., Botta, G., Cole, A., D'Angelo, L., De Girolamo, P., Dennison, N., Dickel L., Di Cosmo, A., Di Cristo, C., Gestal, C., Fonseca, R., Grasso, F., Kristiansen, T., Kuba, M., Maffucci, F., Manciocco, A., Mark, F. C., Melillo, D., Osorio, D., Palumbo, A., Perkins, K., Ponte, G., Raspa, M., Shashar, N., Smith, J., Smith, D., Sykes, A., Villanueva, R., Tublitz, N., Zullo, L., y Andrews, P. (2014). Cephalopods in neuroscience: Regulations, Research and the 3Rs. Invertebrate Neuroscience, 14: 13-36. 
Iglesias, J., Fuentes, L. y Villanueva, R. (2014). Cephalopod culture. Springer. The Nederlands. 494 p.
Seibel, B. A., Robison, B. H., y Haddock, S. H. D. (2005). Post-spawning egg care by a squid. Nature, 438: 929.
Vidal, E.A.G., Villanueva., R., Andrade, J. P., Gleadall, I. G., Iglesias, J., Kouetajj, N., Rosas, C., Segawa, S., Grasse, B., Franco-Santos, R. M., Albertin, C. B., Caamal-Monsreal, C., Chimal, M. E., Edsinger-Gonzales, E., Gallardo, P., Le Pabicjj, C., Pascual, C., Roumbedakis, K. y Wood, J. (2014). Cephalopod culture: current status of main biological models and research priorities. Advances in Marine Biology, 67: 1-98. 
Villanueva, R. y Norman, M. D. (2008). Biology of the planktonic stages of benthic octopuses. Oceanography and Marine Biology: An Annual Review, 46: 105-202.
Villanueva, R.,  Staaf, D. J., Argüelles, J., Bozzano, A., Camarillo-Coop, S., Nigmatullin, C. M., Petroni, G., Quintana, D., Sakai, M., Sakurai, Y., Salinas-Zavala, C. A., De Silva-Dávila, R., Tafur, R., Yamashiro, C. y Vidal E. A. G. Vidal. (2012). A laboratory guide to in vitro fertilization of oceanic squids. Aquaculture, 342-343: 125-133.

AGRADECIMIENTOS

Nos gustaría expresar nuestro agradecimiento a la tripulación de los barcos pesqueros de las lonjas de Barcelona, Vilanova i la Geltrú y Tarragona por su inestimable ayuda en la recolección de cefalópodos. Agradecemos a Marc Gasser (ICM) por las fotografías del pulpo blanco, así como su encomiable ayuda con las técnicas de fotografía. 

Fernando Ángel Fernández-Álvarez recibe un Contrato Predoctoral para la Formación de Doctores del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO). La investigación está financiada por el MINECO bajo los proyectos CALOCEAN-1 (AGL2009-11546) y CALOCEAN-2 (AGL2012-39077).

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